⑴固定相選擇
柱色譜中提到的吸附劑都可以用作為薄層色譜的固定相，分離性能及使用選擇同柱色譜的選擇原則相同(各種吸附劑見柱色譜表1)。
一般用于薄層色譜時，要求吸附劑的粒度更小。商品吸附劑區分為色譜級(用于柱色譜)和薄層色譜級(用于薄層色譜)。
⑵展開劑選擇
薄層色譜展開劑的選擇和柱色譜一樣，主要根據樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。展開劑的極性越大，對化合物的洗脫力也越大。(各種溶劑極性見柱色譜表2)。
選擇展開劑時，除參照表列溶劑極性來選擇外，更多地采用試驗的方法，在一塊薄層板上進行試驗：
①若所選展開劑使混合物中所有的組分點都移到了溶劑前沿，此溶劑的極性過強；
②若所選展開劑幾乎不能使混合物中的組分點移動，留在了原點上，此溶劑的極性過弱。
當一種溶劑不能很好地展開各組分時，常選擇用混合溶劑作為展開劑。先用一種極性較小的溶劑為基礎溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調整極性，再次試驗，直到選出合適的展開劑組合。合適的混合展開劑常需多次仔細選擇才能確定。
⑶相對移動值
從點樣原點開始到展開后的溶劑前沿，是溶劑的移動距離，記為lo，混合物中各組分的移動距離分別記為l1，l2，l3 …(移動值示意圖)。
在不同的展開條件下，各化合物的移動距離不會相同，而在同一條件下，相對于展開劑的移動距離，各化合物有可比較的展開數據，稱為相對移動值，或比移值：
Rf=li/lo
在相同條件下測得的比移值可以用于化合物的薄層色譜特征值進行比較對照。
⑷顯色
分離的化合物若有顏色，很容易識別出來各個樣點。但多數情況下化合物沒有顏色，要識別樣點，必須使樣點顯色。通用的顯色方法有碘蒸氣顯色和紫外線顯色。
①碘蒸氣顯色：將展開的薄層板揮發干展開劑后，放在盛有碘晶體的封閉容器中，升華產生的碘蒸氣能與有機物分子形成有色的締合物，完成顯色。
②紫外線顯色：用摻有熒光劑的固定相材料(如硅膠F，氧化鋁F等)制板，展開后在用紫外線照射展開的干燥薄層板，板上的有機物會吸收紫外線，在板上出現相應的色點，可以被觀察到。
有時對于特殊有機物使用專用的顯色劑顯色。此時常用盛有顯色劑溶液的噴霧器噴板顯色。
